生物堿的分離方法的確很多，既有經典的分離方法，如溶劑萃取法、蒸餾法、沉淀法、鹽析法、結晶法、膜滲透升華法等，也有較為現代、先進的分離方法，如色譜分離法。

　　1.硅膠柱色譜分離法

　　硅膠柱色譜分離法主要利用二氧化硅作為填料，是較為常用的柱色譜分離方法。硅膠為中性無色顆粒，其性能穩定。硅膠層析柱適用范圍廣，既能用于非極性生物堿也能用于極性生物堿，且成本低，操作方便，是常見的生物堿的分離方法。

　　2.氧化鋁柱色譜分離法

　　氧化鋁柱色譜分離法是以氧化鋁作為填料的層析分離法，適合于酸性大、活化溫度較高的生物堿的分離。比如采用氧化鋁層析方法正向分離非酚性粉防己堿與粉防己若林堿，其Rf值適中，展開后放置10min以顯色劑噴濕潤效果為最好、且穩定，可得到較好的效果。這種柱色譜分離法也是較為常用的生物堿分離的方法之一。這是由于許多生物堿極性較小，氧化鋁對它們吸附較小，而雜質常被吸附。

　　3.離子交換樹脂分離法

　　離子交換樹脂對吸附質的作用主要是通過靜電引力和范德華力達到分離純化化合物的目的。隨著人們對生物堿的認識和了解，離子交換樹脂已應用于生物堿的分離提取中。離子交換技術有設備簡單、操作方便、生產周期短、能源消耗少、成本低、產品純度高、不吸潮、不加輔料就可以成型等特點。而傳統的水煮法和水醇法提取分離得到的制劑總是又黑、又大、又粗，使用極不方便;有機溶劑萃取方法，溶劑用量大，環境污染嚴重。因而離子交換樹脂法在生物堿的提取、分離的研究與生產中應用日益廣泛。

　　4.高速逆流色譜分離法

　　高速逆流色譜分離法(high speed coutercurrent chromatography，簡稱HSCCC)是一種新的分離技術，它對生物堿的分離和制備具有很大的優勢，特別是對進樣量較大的樣品具有獨特的優點，其應用前景越來越引人注目。

      經過前期對多糖的提取，去除蛋白質、色素、小分子等物質得到粗多糖，而這些粗多糖其實是由很多分子量、結構不同的多糖混合而成。為了得到純的多糖即均一性多糖，仍需進一步對這些粗多糖進行分離純化。

　　1、分步沉淀法

　　多糖的結構和分子量不同，其極性大小不同，在有機溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據這一原理，可以依此增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來。但是分級沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱層析法等進一步純化，方可得到均一性的多糖。

　　2、柱層析法

　　要獲得均一性的多糖，一般是先經過陰離子交換柱進行粗步純化，然后再用凝膠柱進一步純化。有些多糖也采用大孔樹脂柱進行純化。下面對這三種柱層析法進行詳細介紹。

　　3、陰離子交換法

　　一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類和高等植物的多糖進行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱對大杯香菇等菌類、玉米等植物、桑黃等藻類粗多糖進行分離純化。使用DEAE-52填料進行多糖的初步分離純化，該柱子一般直徑偏大，其中以2.6cm最多，操作過程中流動相的流速也較快，流速一般在0.7-2ml/min之間，以1ml/min最多，至于柱子的長度，選擇范圍較廣，從25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在對菌類、植物和藻類粗多糖的初步分離純化中，在選擇層析柱的直徑、流速和長度的方面與DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流動相都是純水和不同濃度的NaCl溶液。

　　4、凝膠色譜法

　　凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關系實現分離，類似于分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（SephadexG）、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝膠ToyopearlHW等。多糖的進一步分離往往會選擇用各種凝膠進行分離純化。選擇使用哪一種凝膠對多糖進行純化的標準是多糖的分子量，不同種類和型號的凝膠能夠分離多糖類型和分子量范圍不同。凝膠柱的柱子規格常具有長而細的特點，直徑以1.6cm偏多。無論什么類型的凝膠柱，流動相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。

一、黃酮提取

（一）溶劑萃取法：

   黃酮苷和極性較大的苷元：甲醇，乙醇，甲醇-水（1：1），丙酮，乙酸乙酯。

    多糖苷：沸水

    花色苷：0.1%鹽酸進行提取。

    苷元：氯仿，乙醚，乙酸乙酯。

   注意：苷類提取防止酶解。

（二）堿提酸沉法

 常用堿水：石灰水，Na₂CO₃，稀NaOH，堿性稀醇。

    酸沉：鹽酸

注意：酸堿濃度不宜過高。

（三）炭粉吸附法：適于苷類的精制。大部分可被7%酚-水洗下。

二、分離方法

分離的基本依據：

極性差異、酸性強弱、分子大小和特殊結構。

（一）柱色譜法

1、硅膠柱色譜法

適于分離異黃酮，二氫黃酮（醇）和高度甲基化或乙酰化的黃酮及黃酮醇類。

    分離苷元時：氯仿-甲醇混合溶劑洗脫。

    分離苷時：氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水

2、聚酰胺柱色譜

規律：

A：苷元相同時，以含水移動相洗脫，被吸附的強弱順序為：  苷元>單糖苷>雙糖苷>雙糖鍵苷。

B：與酚羥基的數目有關，數目越多，吸附力越強。與酚羥基的位置有關，如果酚羥基所處的位置易形成分子內氫鍵，則吸附力減弱。

C：不同類型黃酮類化合物，被吸附的強弱順序為：黃酮醇>黃酮>二氫黃酮>異黃酮。  

D：分子內芳香化程度越高，共軛雙鍵越多，則吸附力越強。

查耳酮>二氫黃酮，  黃酮>二氫黃酮

3、葡聚糖凝膠色譜法

   凝膠類型：Ssephadex LH-20和Sephadex G兩種類型的凝膠。分離苷元時：利用吸附作用，游離酚羥基數目越多，則吸附力越強，越難洗脫。分離苷時：主要靠分子篩，洗脫時按苷分子量由大到小的順序依次被洗脫出柱體。

黃酮類化合物              取代基                 V_e/V_o

芹菜素                  5，7，4‘-三羥基         5.3

木犀草素          5，7，3‘，4’-四羥基          6.3

槲皮素            3，5，7，3'，4'-五羥基           8.3

楊梅素       3，5，7，3‘，4’，5‘-六羥基         9.2

山柰酚-3-鼠李糖基        三糖苷                 3.3

   半乳糖-7-鼠李糖苷

槲皮素-3-蕓香糖苷        雙糖苷                 4.0

槲皮素-3-鼠李糖苷         單糖苷                 4.9

常用的洗脫劑：堿性水溶液，含鹽水溶液、醇及含水醇

（二）PH梯度法：用不同濃度的堿分離

（三）硼酸絡合法     具有鄰二酚羥基的黃酮類化合物可與硼酸絡合生成易溶于 水的化合物